區別是：1、對應版本不同，「.xls」檔案對應的是「Office EXCEL 2003」及以前的版本，「.xlsx」檔案則對應2007及後期的版本；2、「. xlsx」檔案相比較「.xls」檔案佔用空間小，運算速度也會快一點。
二者的差異有以下幾點：
一、對應軟體版本的不同
.xls檔案副檔名對應的是Microsoft Office EXCEL 2003及先前的版本。
.xlsx檔案副檔名對應的是Microsoft Office EXCEL 2007及後期的版本。
二、在核心結構上的差異：
.xls檔案是一個特有的二進位格式，其核心結構是複合文檔類型的結構。
.xlsx檔案的核心結構是 XML 類型的結構，採用的是基於 XML 的壓縮方式，使其佔用的空間更小。
三、二者對於軟體相容方面的不同
.xls檔案既可以用Office EXCEL 2003版本打開，也可以用Office EXCEL 2007及後期的版本打開。
.xlsx檔案只能用Office EXCEL 2007及後期的版本打開，Office EXCEL 2003版本是使用不了.xlsx格式的檔案的。如果要用Office EXCEL 2003版開啟.xlsx文件，可以安裝Office相容性補丁包，透過套用相容性修補程式包，Office EXCEL 2003的使用者可以開啟、編輯、儲存.xlsx格式的文件。
此相容性補丁包也能結合Office Word Viewer 2003，Excel Viewer 2003和PowerPoint Viewer 2003使用來瀏覽用新格式儲存的檔案。
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